Imagerie

L’imagerie par microscopie optique à fluorescence est un domaine en pleine expansion et est devenue une méthode incontournable pour la recherche en biologie. En effet, des avancées technologiques récentes ont permis le développement de microscopes plus rapides et de meilleure résolution permettant de collecter des images tridimensionnelles d’un échantillon biologique vivant. Parallèlement, des progrès importants ont été réalisés dans le développement de sondes fluorescentes stables et lumineuses ce qui a révolutionné la capacité à suivre individuellement certaines cellules in vivo.

Le microscope confocal est un dispositif particulier de microscope photonique qui permet de localiser des molécules spécifiques, dans le contexte cellulaire, et apporte d’importantes contributions à l’étude fonctionnelle des systèmes biologiques à différents niveaux d’organisation : sub-cellulaire, cellulaire, tissulaire ou embryonnaire. Grâce à sa très faible profondeur de champs (environ 400 nm) cette technique permet de sectionner un échantillon en tranche optique de très bonne qualité sans traitement ultérieur. L’utilisation de traceurs fluorescents très spécifiques permet de localiser in situ avec une résolution spatiale de l’ordre quelques centaines de nanomètres, des composants macro-moléculaires tels que : acides nucléiques, protéines, mais également des petites molécules telles que des peptides, lipides, et même des ions.

Service d’imagerie cellulaire

Responsable de l’imagerie cellulaire

Larbi AMAZIT – IR IPSUD

Tél: 01 45 59 53 41 / 01 49 59 18 31 / 01 49 59 66 06

E-mail: larbi.amazit@u-psud.fr

Base spectrale des fluorochromes organiques
(P. Leclerc compil. 03-02-15)

Avant de choisir un fluorochrome il faut impérativement savoir sur quel(s) instrument(s) sera étudié le signal de fluorescence afin de déterminer quelles en sont les possibilités spectrales en terme d’excitation et d’émission.
Avec le microscope confocal SP5-AOBS, vous disposez des raies d’excitation laser : 405, 458, 476, 488, 496, 514, 561 et 633nm. Le système AOBS va permettre d’envoyer la lumière de la longueur d’onde d’excitation choisie vers l’objet et de récupérer toute la fluorescence émise par l’échantillon sur le prisme de diffraction. Le positionnement des fentes de détection devant les différents détecteurs permet de sélectionner  volonté la bande spectrale d’émission dans laquelle on désire réaliser une image. Ainsi le choix des fluorochromes est principalement déterminé par la longueur d’onde d’excitation, et, dans le cas où plusieurs marqueurs sont combinés, par des longueurs d’ondes d’émission suffisamment espacées pour éviter les risques de crosstalk.

Les autres critères à prendre en compte sont:

  • Le coefficient d’extinction molaire ε (on parle aussi d’absorbance molaire) qui est un paramètre d’absorption découlant directement de la loi de Beer- Lambert et qui exprime la variation d’intensité lumineuse (D.O.) en fonction de la concentration molaire de la molécule absorbante et de la longueur du trajet optique.
  • le rendement quantique Φf (QE : quantum efficiency ou quantum yield) qui est égal au rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons reçus dans la zone spectrale d’excitation du fluorochrome. Sa valeur varie donc entre 0 et 1. Ainsi un fluorochrome très efficace va émettre beaucoup de photons de fluorescence par rapport au nombre de photons d’excitation qu’il aura reçu.
  • le produit des 2 valeurs précédentes ε.Φf qui va déterminer la brillance du fluorochrome.
  • la stabilité temporelle de la brillance du fluorochrome lorsqu’il est soumis a une excitation prolongée. Tous les fluorochromes organiques perdent de la brillance lorsqu’ils sont excités. C’est le phénomène du photoblanchiment (photo-bleaching ou bleaching). Très dépendant des conditions du milieu : pH , présence de radicaux libres, etc, ce n’est que l’expérience qui permet d’appréhender plus ou moins bien ce paramètre. On peut partiellement atténuer ce phénomène en utilisant des milieux de montages anti-blanchiment mais, là encore, c’est l’expérience qui permettra de déterminer les bonnes conditions.

La liste qui suit n’est pas exhaustive mais elle offre quand même un choix assez complet.

En cours…